Teknik Analisis Molekuler II:
Western Blot, Flow Cytometry, dan Interpretasi Data

Bramadi Arya, S.Si., M.Biotech
Biologi Molekuler II · Pertemuan 10

Program Studi S1 Ilmu Biomedis
Universitas Syedza Saintika

Sasaran pertemuan

Pertemuan 10 · Western blot, flow cytometry, dan interpretasi data qPCR serta Western blot

Sub-CPMK 10: menganalisis hasil eksperimen qPCR dan Western blot serta pemanfaatannya dalam diagnosis.

Dari asam nukleat ke protein

  • qPCR dan sequencing mengukur DNA dan RNA
  • Untuk menilai protein, kita memakai teknik lain
  • Dua yang utama: Western blot dan flow cytometry

Prinsip Western blot

Empat tahap utama:

  1. Pemisahan: protein dipisah menurut ukuran dengan SDS-PAGE
  2. Transfer: protein dipindahkan ke membran
  3. Deteksi: antibodi primer mengenali protein target, antibodi sekunder berlabel memberi sinyal
  4. Visualisasi dan kuantifikasi intensitas pita

Western blot menjawab: apakah suatu protein ada, berapa ukurannya, dan seberapa banyak secara relatif.

Membaca hasil Western blot

  • Posisi pita: menunjukkan ukuran protein (dibandingkan marka)
  • Intensitas pita: mencerminkan jumlah relatif protein
  • Kontrol muatan (misalnya aktin): memastikan jumlah sampel setara antar jalur
  • Tanpa kontrol muatan, perbedaan intensitas bisa menyesatkan

Prinsip flow cytometry

  • Sel mengalir satu per satu melewati sinar laser
  • Hamburan cahaya memberi info ukuran dan granularitas
  • Antibodi berlabel fluoresen menandai penanda pada sel

Kegunaan:

  • Menghitung populasi sel tertentu
  • Menganalisis penanda permukaan
  • Menilai siklus sel dan apoptosis

Interpretasi data qPCR: latihan

Prinsip yang wajib diingat:

  • Ct kecil berarti target awal banyak
  • Selalu bandingkan terhadap gen referensi
  • Perhatikan kontrol negatif: jika ikut naik, ada kontaminasi
  • Kurva melting (pada SYBR Green) memastikan produk spesifik, bukan produk samping

Menghindari kesalahan tafsir umum

  • Menyimpulkan perbedaan tanpa pengulangan dan analisis statistik
  • Mengabaikan kontrol muatan pada Western blot
  • Menafsirkan pita non-spesifik sebagai hasil positif
  • Membandingkan sampel yang preparasinya tidak setara

Kualitas kesimpulan tidak pernah melebihi kualitas kontrol dan desain eksperimen.

Pemanfaatan diagnostik

  • Western blot: uji konfirmasi pada beberapa penyakit infeksi
  • Flow cytometry: imunofenotipe pada keganasan darah, hitung limfosit
  • qPCR: kuantifikasi beban penyakit dan pemantauan terapi

Ketiganya sering dipakai bersama untuk memperkuat kesimpulan.

Ringkasan

  • Western blot mendeteksi protein berdasarkan ukuran dan jumlah relatif, butuh kontrol muatan
  • Flow cytometry menganalisis sel satu per satu berdasarkan penanda berlabel
  • Interpretasi qPCR bergantung pada Ct, gen referensi, kontrol, dan kurva melting
  • Kontrol dan pengulangan menentukan validitas kesimpulan

Bacaan: Alberts et al. (2022) Bab 8; Lodish et al. (2021).

Terima kasih