Teknik Analisis Molekuler I:
qPCR dan Sequencing

Bramadi Arya, S.Si., M.Biotech
Biologi Molekuler II · Pertemuan 9

Program Studi S1 Ilmu Biomedis
Universitas Syedza Saintika

Sasaran pertemuan

Pertemuan 9 · Real-time PCR (qPCR) dan sequencing (Sanger dan NGS)

Sub-CPMK 9: menjelaskan prinsip qPCR dan sequencing.

Dari PCR menuju qPCR

  • PCR biasa memberi tahu apakah target ada (kualitatif)
  • qPCR mengukur berapa banyak target ada (kuantitatif)
  • Kuncinya: jumlah produk dipantau secara real-time pada setiap siklus

Prinsip qPCR

  • Sinyal fluoresensi meningkat seiring bertambahnya produk
  • Ct (cycle threshold): siklus saat sinyal melewati ambang
  • Semakin banyak target awal, semakin kecil nilai Ct

Dua kimia deteksi umum:

  • SYBR Green: pewarna yang mengikat DNA untai ganda
  • Probe TaqMan: probe berlabel yang lebih spesifik

Kuantifikasi: absolut dan relatif

  • Absolut: membandingkan dengan kurva standar untuk mendapat jumlah pasti
  • Relatif: membandingkan ekspresi gen target terhadap gen referensi (housekeeping)
  • Metode relatif populer: 2 pangkat negatif delta-delta Ct

Interpretasi data qPCR akan diperdalam di Pertemuan 10.

Aplikasi qPCR

  • Deteksi dan kuantifikasi patogen (misalnya viral load)
  • Pengukuran ekspresi gen
  • Genotyping dan deteksi varian
  • Menjadi standar pada banyak uji diagnostik molekuler

Sequencing: membaca urutan basa

Menentukan urutan A, T, G, C dari suatu fragmen DNA.

  • Sanger: akurat, cocok untuk fragmen tunggal dan verifikasi
  • NGS (Next-Generation Sequencing): paralel masif, membaca jutaan fragmen sekaligus

Sanger vs NGS

Aspek Sanger NGS
Kapasitas Satu fragmen per reaksi Jutaan fragmen paralel
Skala Kecil, terarah Genom, ekson, atau panel besar
Biaya per basa Tinggi Rendah
Penggunaan Verifikasi, fragmen pendek Penemuan varian, genomik skala besar

Keduanya saling melengkapi, bukan saling menggantikan.

Alur umum NGS

  1. Preparasi library: DNA dipotong dan diberi adaptor
  2. Sequencing paralel masif
  3. Analisis bioinformatika: penyelarasan ke genom referensi dan pemanggilan varian
  4. Interpretasi klinis atau riset

NGS mengubah diagnostik genetik, dari satu gen menjadi ratusan gen sekaligus.

Ringkasan

  • qPCR mengukur jumlah target secara real-time melalui nilai Ct
  • Kuantifikasi relatif memakai gen referensi dan metode delta-delta Ct
  • Sanger akurat untuk fragmen tunggal; NGS untuk skala besar
  • Keduanya menjadi fondasi diagnostik dan riset molekuler

Bacaan: Brown, T.A. (2016); Alberts et al. (2022) Bab 8.

Terima kasih